Wraz z dynamicznym rozwojem nauk weterynaryjnych wśród hodowców psów wzrosło zainteresowanie technikami wspomaganego rozrodu. Takie metody jak zapłodnienie in vitro czy przenoszenie zarodków wychodzą powoli ze ścian laboratoriów naukowych i zaczynają służyć komercyjnej praktyce. W związku z pojawieniem się przepisów służących poprawie jakości hodowli, właściciele są niejako zmuszeni do kontroli płodności zwierząt przeznaczonych do rozrodu.
Kontrole dotyczące reproduktorów, polegające w części pozaklinicznej na laboratoryjnej analizie nasienia, ujawniają coraz więcej przypadków zaburzeń jakości ejakulatów, takich jak aspermia, azoospermia, oligozoospermia, asthenozoospermia czy teratozoospermia. Wskazuje to na samca jako coraz częstszą przyczynę niepłodności, do tej pory bowiem o niepłodność „obwiniano” głównie suki. Artykuł niniejszy ma na celu zapoznanie lekarzy praktyków z farmakologicznymi schematami postępowania w przypadkach, w których przyczyną niepłodności jest obniżenie parametrów nasienia.
Prawidłowe parametry nasienia psa
Tabela I. Definicje określające jakość pobranego nasienia
Rutynowo nasienie od psa pobiera się metodą masturbacji. Powinno odbywać się w obecności suki w cieczce lub z użyciem feromonów (wata albo inny absorbujący materiał, nasączony wyciekiem pochwowym suki w rui). Ejakulaty uzyskane od psów niestymulowanych mają często mniejszą objętość i obniżoną całkowitą liczbę plemników. W tab. I zestawiono najczęściej stosowane terminy służące do określania stanu nasienia.
Badanie nasienia powinno obejmować ocenę następujących parametrów:
Objętość
Ryc. 1. Prawidłowe nasienie psa w analizatorze typu CASA.
Pies oddaje nasienie w trzech frakcjach. Pierwsza frakcja, zwana przednasienną, ma niewielką objętość – średnio około 0,5 ml. Jest to głównie wydzielina gruczołu krokowego ze znikomą liczbą plemników. Frakcja druga – nasienna, pochodząca z najądrzy i jąder, zawiera właściwy „ładunek” nasienia, czyli plemniki zawieszone w osoczu nasienia. Średnia objętość tej frakcji wynosi ok. 1,5-2 ml. Frakcja trzecia – ponasienna, będąca wydzieliną gruczołu krokowego, stanowi o objętości całego ejakulatu. Jej średnia objętość to ok. 20 ml.
W większości przypadków podczas pobrania nasienia uzyskujemy ejakulat zawierający wszystkie trzy frakcje.
Barwa i konsystencja
Prawidłowe nasienie powinno być mlecznoszare, białe lub białoszare. Wygląd przejrzysty, klarowny świadczy o obecności jedynie frakcji bezplemnikowych. Im ciemniejsza barwa ejakulatu i gęstsza jego konsystencja, tym większa powinna być koncentracja plemników. Niezależnie od barwy nasienie powinno być każdorazowo oceniane pod mikroskopem pod kątem obecności plemników. Znane są przypadki psów z azoospermią, oddające ejakulat z dużą ilością tłuszczu, który makroskopowo może przypominać prawidłowe nasienie zawierające plemniki. Barwa żółta świadczy o domieszce moczu, a także o żółtaczce. Zabarwienie brązowe lub czerwone (hematospermia) może świadczyć odpowiednio o obecności wyługowanej albo świeżej krwi. Najczęstszymi przyczynami hematospermii u psów są choroby gruczołu krokowego, guzy weneryczne lub uszkodzenia cewki moczowej. Konsystencję nasienia psa określa się jako wodnisto-mleczną.
pH
Ryc. 2. Oligozoospermia – widok z analizatora CASA.
Prawidłowy odczyn niefrakcjonowanego nasienia zawiera się między 6,4 a 6,8. Większość autorów sugeruje przeprowadzenie badania bezpośrednio po pobraniu, przy użyciu pH-metru lub papierków lakmusowych.
Ruchliwość
Ocenę nasienia psa pod kątem ruchliwości lepiej przeprowadzać w temperaturze pokojowej niż w temperaturze ciała. Powinno się unikać nagłych spadków temperatury. Według niektórych doniesień dotyczących badań ruchliwości psich plemników w warunkach tropikalnych, przyczyną słabej ruchliwości był brak klimatyzacji w pomieszczeniach laboratoryjnych.
Ryc. 3. Wybrane parametry nasienia przed leczeniem GnRH.
U psów odsetek plemników o ruchu postępowym nie jest zależny od częstotliwości pobrań. Czynnikiem wpływającym negatywnie na ruch plemników może być wiek reproduktora. W badaniach dotyczących mężczyzn odsetek plemników o ruchu postępowym spadał o 0,27% z każdym rokiem po 45. roku życia. U psów prawidłowy udział plemników o ruchu postępowym w ejakulacie powinien wynosić około 70%. Odsetek plemników o ruchu postępowym jest wprost proporcjonalny do odsetka plemników o prawidłowej budowie morfologicznej.
Brak ruchu plemników prawidłowych morfologicznie może wynikać z zanieczyszczeń związanych z pobraniem ejakulatu, obecności toksyn, np. bakteryjnych, nagłych wahań temperatury, rzadziej z ukrytych wad witki.
Ryc. 4. Stan po zakończonym cyklu leczenia.
Do oceny ruchliwości plemników w medycynie człowieka, według WHO 2010, stosuje się następujące stopnie: ruchliwość postępowa (PR), ruchliwość niepostępowa (NP) i brak ruchu (IM).
Do określania jakości nasienia używany jest także komputerowy system CASA (Computer-Assisted Sperm Analysis), który jest najbardziej obiektywnym i kompleksowym systemem do oceny jakości nasienia. Ułatwia on szybką ocenę koncentracji, ruchliwości i wielu innych wskaźników. W medycynie człowieka jest on już powszechnie znany i wykorzystywany, a w andrologii weterynaryjnej funkcjonuje dopiero od niedawna. Pozwala on na ocenę wielu innych parametrów ruchu plemnika, m.in. prędkości linearnej, krzywej prędkości czy bocznego przesunięcia główki. Na podstawie uzyskanych wartości można wyliczyć takie współczynniki jak Semen Quality Score (Współczynnik Jakości Nasienia) czy Sperm Motility Index (Współczynnik Ruchliwości Plemników), które mogą stać się przydatne u psów w leczeniu niepłodności czy w zabiegach biotechnologicznych z użyciem nasienia konserwowanego w niskich temperaturach. Na podstawie współczynników można wyodrębnić pewne subpopulacje plemników, których rola w andrologii weterynaryjnej nie została jeszcze opisana.
Morfologia
Ryc. 5. Widoczne nieprawidłowe plemniki – podwójna witka, kropla dalsza. Barwienie Sperm-Blue 1250×.
Bardzo istotnym parametrem oceny nasienia jest odsetek plemników o prawidłowej budowie. U psów odsetek ten nie zmienia się w zależności od częstotliwości pobrań nasienia. Obserwuje się za to tendencję do wzrostu odsetka plemników o nieprawidłowej morfologii u starszych samców.
Wady morfologiczne plemników dzieli się na pierwotne (powstałe podczas spermatogenezy) oraz wtórne (powstałe w trakcie dojrzewania). Część wad może powstawać w czasie przygotowywania preparatu. Badania przy użyciu mikroskopu kontrastowo-fazowego potwierdziły, że barwienie może prowadzić do wystąpienia defektów akrosomu, wad główki, wstawki czy witki. Do najczęściej spotykanych wad wrodzonych obserwowanych w psim nasieniu należą okrągłe główki, wybrzuszony akrosom, „Dag defect” wstawki i witki, załamanie witki i kropla dalsza witki (ryc. 5). W andrologii człowieka funkcjonuje indeks teratozoospermii (TZI), czyli całkowita liczba wad podzielona przez całkowitą liczbę wadliwych plemników. Indeks (TZI) określa się w skali od 1 do 3. Wartości powyżej 1,6 skorelowane są z niższym wskaźnikiem zajścia w ciążę.
U psów odsetek plemników o prawidłowej budowie powinien przekraczać 60. Parametr ten obliczany jest także przez system CASA, a wyniki są zgodne z wynikami uzyskanymi w tradycyjnych metodach szacowania.
Koncentracja i całkowita liczba plemników
Koncentracja jest mało wartościowym wskaźnikiem przy ocenie jakości nasienia psa, powinno się ją jednak każdorazowo określać. Koncentracja pomnożona przez objętość daje całkowitą liczbę plemników w ejakulacie. U psów prawidłowy ejakulat powinien zawierać powyżej 300 milionów plemników. Całkowita liczba plemników może zmniejszać się wraz ze zwiększoną częstotliwością pobrań nasienia, co jest związane z wyczerpywaniem się rezerwy plemników znajdujących się w najądrzach. Dlatego też, jeśli planujemy pobieranie nasienia lub krycie, najlepiej robić to w odstępach minimum 2-5-dniowych. Ponadto całkowita liczba plemników w ejakulacie jest wprost proporcjonalna do wielkości jąder. Stres i ból mogą powodować u psów azoospermię lub oligozoospermię (1, 2). Tradycyjną metodą określania koncentracji jest użycie hemocytometru.
Określanie obecności i liczby innych komórek
W nasieniu spotyka się komórki pochodzące z gruczołu krokowego, komórki nabłonka cewki moczowej, spermatogonia, erytrocyty i(lub) komórki nacieku zapalnego. Ich identyfikacja i ustalenie liczby są bardzo pomocne w rozpoznawaniu zaburzeń jakości nasienia psów. Obecność komórek zapalnych nie koreluje ściśle ze wzrostem liczby bakterii w nasieniu. W jednej z prac w 44 przypadkach braku obecności w nasieniu komórek zapalnych wyhodowano bakterie tlenowe (1, 4). Poza tym ważna jest także ocena składu płynu nasiennego – składu wydzieliny gruczołu krokowego, białek, enzymów i elektrolitów, których ilość zmienia się w zależności od stanu zdrowotnego samca (głównie choroby gruczołu krokowego), częstotliwości pobrań, wieku itp. (4, 5).
Żywotność
Coraz częściej przy ocenie żywotności plemników psów stosuje się barwienie w kierunku określenia odsetka martwych plemników, a także HOS (Hypo-osmotic-swelling) – test służący do oceny integralności błony plazmatycznej plemnika, dający informację o prawidłowej funkcjonalności i żywotności plemników.
Zaawansowane techniki oceny nasienia
W celu dokładniejszego określenia ruchliwości i morfologii plemników nasienie może być filtrowane (filtr może zatrzymywać plemniki o słabym ruchu i nieprawidłowej budowie). Nasienie filtrowane cechuje się obecnością plemników o wysokiej ruchliwości, z małym odsetkiem wad morfologicznych, ale koncentracja plemników jest mniejsza niż przed filtracją.
Plemniki można także selekcjonować za pomocą dwustopniowego gradientu gęstości lub wykorzystując prawidłowy ruch plemników w metodzie Swim-Up. Obydwie metody opierają się na prawidłowym ruchu plemników podczas migracji między specjalnymi roztworami.
Innymi sposobami oceny jakości nasienia są badania morfologiczne organelli ruchliwych plemników (MSOME – Motil Sperm Organelle Morphology Evaluation) przy dużym powiększeniu i badanie rozproszenia chromatyny plemników (SCD – Sperm Chromatin Dispersion). Wakuolizacja jądra plemnika i fragmentacja DNA są istotnie skorelowane z większą zamieralnością zarodków.
Ocena morfologiczna plemników jest jednym z najważniejszych parametrów określających płodność samca. Standardowe badanie morfologiczne pod małym powiększeniem mikroskopu pozwala na ogólną oceną budowy plemników. Jednak ze względu na ograniczoną precyzję stwarza ryzyko przeoczenia wielu anomalii, istotnych z punktu widzenia płodności. Bardzo istotną zmianą, łatwą do przeoczenia w standardowym badaniu morfologicznym, jest obecność jądrowych wakuoli w główce plemników. Obecność wakuoli nie upośledza prawidłowego przebiegu zapłodnienia, może jednak zwiększać wczesną umieralność zarodków.
Technika MSOME polega na przyżyciowej ocenie morfologicznej organelli plemników pod 6600-krotnym powiększeniem. Możliwość tak dużego powiększenia (preparatów niebarwionych) powstała dzięki zastosowaniu odwróconego mikroskopu świetlnego, wyposażonego w optykę kontrastu interferencyjnego według Nomarskiego, wspartą obrazowaniem cyfrowym.
Inną nowatorską metodą badania jakości nasienia jest test SCD. Według najnowszych doniesień, prawidłowa funkcja plemników jest istotnie powiązana ze strukturą ich chromatyny oraz integralnością DNA. Barwienie w teście SCD pozwala na wizualizację rozproszonej pętli DNA, tworzącej charakterystyczną aurę wokół główki plemnika – tak zwane „halo”.
U psów najczęściej diagnozuje się azoospermię i oligozoospermię. Przyczyny tych stanów mogą być przedjądrowe, jądrowe lub zajądrowe. Wśród przyczyn dotyczących jąder można wymienić zaburzenia hormonalne, wzrost temperatury w mosznie, długo utrzymujące się stany gorączkowe, wnętrostwo, obojnactwo, zaburzenia rozwojowe jąder, nowotwory, urazy mechaniczne czy też brak odpowiedniej stymulacji przed pobraniem nasienia.
Leczenie
Do poprawy parametrów nasienia u psów, ale także u innych gatunków zwierząt, stosuje się:
– prostaglandyny
– inhibitory prolaktyny
– agonistów GnRH
– suplementy diety.
Prostaglandyny (Pg)
PgF2α podawana przed poborem nasienia powoduje zwiększenie liczby plemników w ejakulacie jako efekt większej koncentracji i objętości nasienia. Zależność tę wykazano u byka, ogiera, królika, tryka, a także u człowieka i psa.
Mechanizm działania prostaglandyn na męski układ rozrodczy nie jest do końca poznany. Przyjmuje się, że PgF2α oddziałuje bezpośrednio, kurcząc elementy samego jądra, a także najądrza, co skutkuje wzrostem przepływu nasienia z najądrzy do nasieniowodów i wzmaga efekt poprawy parametrów nasienia. W nasieniowodach receptory PgF2α występują bardzo licznie i tkanki te są bardzo wrażliwe na działanie leków z tej grupy.
Po podaniu prostaglandyn u wielu gatunków zwierząt (byk, tryk, szczur) zaobserwowano także wzrost libido podczas pobierania nasienia. Podobną reakcję stwierdzono u psów podczas pobierania nasienia bez obecności suki. Według niektórych autorów, podanie 0,1 mg/kg PgF2α 15 minut przed masturbacją zwiększyło całkowitą liczbę plemników o ponad 200% w stosunku do grupy kontrolnej (4). Ponadto nasienie uzyskane po podaniu prostaglandyn, po mrożeniu lub schłodzeniu nie różniło się parametrami od nasienia kontrolnego.
Prostaglandynę podaje się na 10-20 minut przed pobraniem. Jej użycie zalecane jest szczególnie w przypadku niedoświadczonych reproduktorów lub psów bojaźliwych bez obecności suki w cieczce. U psów obserwuje się typowe objawy uboczne działania prostaglandyn u tego gatunku, takie jak wymioty, gorączka, przyspieszenie oddechów i akcji serca, duszność, ślinotok, niekontrolowane oddawanie moczu i kału. Hodowca powinien mieć świadomość możliwości ich wystąpienia.
Analogi GnRH
GnRH to hormon uwalniający LH i FSH z tylnego płata przysadki. LH stymuluje wydzielanie testosteronu przez komórki Leydiga w jądrach. Szczyt stężenia testosteronu pojawia się godzinę po podaniu analogów GnRH. GnRH stosuje się przed pobraniem nasienia u psów z obniżonym libido. Analogi GnRH wykorzystywane są także w celu zwiększenia liczby plemników w ejakulacie w przypadkach oligozoospermii.
Istnieją różne schematy podawania analogów GnRH. Najczęściej stosuje się dawki od 1 do 3 µg/kg raz lub dwa razy w tygodniu przez 3-4 tygodnie. Zazwyczaj powoduje to dość znaczne zwiększenie liczby plemników w ejakulacie, objętości ejakulatu, polepszenie parametrów ruchu oraz spadek odsetka plemników z wadami budowy (3). W wielu przypadkach idiopatycznej oligozoospermii nie są to trwałe efekty, dlatego preparaty GnRH należy stosować w określonym czasie przed planowanym kryciem. Z uwagi na dobre efekty i brak działań niepożądanych analogi GnRH w postaci zastrzyków podskórnych i domięśniowych dość często wykorzystywane są w leczeniu niepłodności. Ryc. 3 i 4 przedstawiają parametry nasienia psa (własny przypadek kliniczny) przed i po zastosowaniu GnRH w dawce 1 µg/kg dwa razy w tygodniu przez trzy tygodnie.
Inhibitory prolaktyny
Hiperprolaktynemia powoduje niedoczynność gonad męskich poprzez zahamowanie wyrzutu GnRH, a co za tym idzie – także gonadotropin przysadkowych, co skutkuje spadkiem stężenia testosteronu. W konsekwencji wysokie stężenie prolaktyny prowadzi do spadku libido, oligoasthenozoospermii, teratozoospermii oraz do zmniejszenia objętości ejakulatu.
Istnieją doniesienia o skutecznym leczeniu tego typu zaburzeń kabergoliną w dawce 5 µg/kg doustnie przez 3-6 tygodni. Jeśli nie widać poprawy parametrów nasienia po 6 tygodniach, podawanie powinno się przerwać, gdyż nie przyniesie ono zamierzonego skutku. Niektórzy badacze uważają, że dość wysoki odsetek psów nie reaguje pozytywnie na leczenie kabergoliną i dla powszechniejszego zastosowania antagonistów dopaminy potrzebne są dalsze badania i obserwacje kliniczne.
Suplementy diety
Istnieją przypuszczenia, że preparaty stosowane w leczeniu zwyrodnień stawów u psów, zawierające glukozaminę oraz wyciągi z małża zielonego, mają także korzystny wpływ na parametry nasienia psów. Są to jednak obserwacje kliniczne niepoparte dowodami naukowymi. Przyjmuje się, że preparaty zawierające glukozaminę usprawniają wychwyt aminokwasów i przez to poprawiają jakość nasienia. Nie ma jednak ustalonych schematów postępowania, a zastosowanie tych produktów wymaga dalszych badań.
Ważnym pierwiastkiem biorącym udział w spermatogenezie jest selen. Występuje on w jądrach w postaci peroksydazy glutationowej będącej zmiataczem wolnych rodników, co w przypadku nasienia ma szczególne znaczenie, gdyż plemniki, z uwagi na wysoką zawartość nienasyconych kwasów tłuszczowych, są szczególnie podatne na niekorzystne działanie aktywnych form tlenu. Korzystny wpływ suplementacji selenu na jakość nasienia potwierdzono u drobiu i świń. Niektórzy autorzy w doniesieniach klinicznych wskazują, że suplementacja doustna tego pierwiastka u psów powoduje wyższą koncentrację, zwiększenie objętości ejakulatu i poprawę parametrów ruchliwości plemników.
Istnieją również dane o korzystnym wpływie kwasów omega-3, a także selenu oraz witamin C i E na jakość nasienia. Suplementy z antyoksydantami mają chronić komórki przed ich niszczeniem przez wolne rodniki (4, 5).
Część praktyków zaleca podawanie preparatów z karnityną w celu poprawy ruchliwości plemników.
■
Artykuł ukazał się Magazyn Weterynaryjny 2015.01,Dr n. wet. Sławomir Giziński,dr n. wet. Ricardo Faundez,lek. wet. Dorota Karska
Zakład Rozrodu Zwierząt, Andrologii i Biotechnologii Rozrodu, Wydział Medycyny Weterynaryjnej SGGW, Warszawa
Ryc. 1-4 – D. Karska, ryc. 5 – R. Faundez
PIŚMIENNICTWO
- Root Kustriz M.V.: The value semen evaluation for practitioners. Theriogenology 68, 329-337, 2007. – 2. Gobello C.: New GnRH analogs in canine reproduction. Anim. Reprod. Scien. 100, 1-13, 2007. – 3. Memon M.A.: Common causes of dog infertility. Theriogenology 68, 322-328, 2007. – 4. Hess M.: Documented and anecdotal effects of certain pharmaceutical agents used to enhance semen quality in the dog Theriogenology 66, 613-617. – 5. Wiebe V., Howard P.: Pharmacologic advances in canine and feline reproduction. Top in Companion Animal. 24 (2), 92-99, 2009.
